Selasa, 20 Mei 2014

Sejarah Kolom Kromatografi

Sejarah kromatografi dimulai sejak pertengahan abad ke 19 ketika penggunaan teknik pemisahan pigmen tanaman seperti klorofil. Kolom kromatografi pertama dikembangkan oleh ahli botani Rusia, Mikhail Tsvet di tahun 1901, ketika dia mencuci larutan organik dari pigmen tumbuhan melalui kolom gelas vertical yang diisi dengan materi yang dapat mengabsorbsi. Dia menemukan bahwa zat warna tumbuhan ini terpisahkan menjadi beberapa pita warna didalam kolom, terbagi beberapa lapisan yang dipisahkan oleh area yang bebas warna.

Kolom kromatografi semakin populer pada tahun 1930 ketika kimiawan Richard Kuhn and Edgar Lederer sukses menggunakan teknik ini untuk memisahkan beberapa material biologi. Sejak saat itu, perkembangan tekinik ini sangatlah cepat dan kolom kromatografi saat ini digunakan dalam bebrbagai jenis teknik. Kolom itu sendiri telah berubah dari tahun ke tahun, tergantung dari tipe kromatografi, namun dengan esensi dan fungsi pemisahan yang sama.



1930
Pada tahun 1938, Harold C. Urey and T. I. Taylor mengembangkan pertama kali kolom resin penukar ion (ion exchange chromatography column) berdasarkan fase diam zeolit. Tehnik ini untuk pertama kalinya memungkinkan pemisahan dari partikel berdasarkan muatan listriknya



1940
Pada tahun 1941, konsep yang menggunakan  air sebagai fase diam yang didukung oleh silica inert yang digabungkan dengan fase gerak kloroform, teknik ini dikembangkan oleh 2 orang kimiawan Inggris, Archer Martin and Richard Synge. Teknik mereka memungkinkan molekul terlarut untuk dapat dipisahkan antara stationary liquid dan  mobile liquid phases, dan hal ini meningkatkan kemampuan pemisahan. Martin dan Synge sangatlah berperan dalam perkembangan luar biasa dari teknik kromatografi selama kurun waktu 1940 sampai 1950.

Pada tahun 1942, kolom kromatografi penukar ion digunakan selama Manhattan Project untuk memisahkan elemen seperti uranium yang dihasilkan oleh ledakan termonuklir

Pada tahun 1944, Erika Cremer menyusun sebuah sistem gas kromatografi menggunakan fasa diam padat

1950
Pada tahun 1957, Marcel Golay, mengkalkulasi penggunaan kolom kromatografi gas yang sangat panjang (lebih dari 90 m) dan diameter yang kecil (sekitar 0.25 mm) dan menggunakan lapisan tipis dari suatu cairan. Ternyata penemuannya ini  memberikan hasil yang sangat meningkatkan kemampuan pemisahan dari banyak molekul yang berbeda. Ini dinamakan kolom kapiler, telah merevolusi teknik kromatografi dan memungkinkan untuk pemisahan ratusan komponen dalam satu kali jalannya analisa

Selanjutnya di tahun 1957, Kolom kalipler nilon pertama kali muncul. Namun walaupun sudah tersedia, kolom ini juga punya keterbatasan dalam hal termerature pengoperasian

Pada tahun 1958, Ilmuwan Inggris James Lovelock pertama kali mengusulkan penggunaan cairan super kritis (kondisi gas pada suhu diatas suhu kritisnya) sebagai fasa gerak untuk kolom kromatografi pada tekanan tinggi

1960
Pada tahun 1961, John Moore, menemukan metode analisis polimer menggunakan kolom gel.

Di tahun 1962, Enst Klesper  melaporkan penggunaan pertama kali dari cairan superkritis dalam kolom kromatografi, menggunakan teknik ini untuk pemisahan porfirin

Tahun 1964, kimiawan dari Amerika, J. Calvin Giddings,  kromatografi cair untuk bisa mencapai kemampuan pemisahan setara dengan gas kromatografi. Ini adalah awal perkembangan teknik yang kemudian di kenal sebagai kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC)









PT Maja Bintang Indonesia

PT MBI adalah distributor/agen/suplier kolom kromatografi

Minggu, 02 Maret 2014

Analisis Senyawa Hidrofilik Pada HPLC

Analisis fase terbalik merupakan bentuk yang paling populer pada pemisahan menggunakan HPLC. Dalam analisis makanan, banyak sampel yang hidrofilik sehingga dapat merusak kolom C18 standar. Berikut ini adalah perbandingan dari dua pilihan untuk meningkatkan analisis senyawa hidrofilik.


Menambahkan Ion Pairing Reagent ke Fase Gerak

Salah satu pilihan untuk meningkatkan waktu retensi sampel hidrofilik adalah dengan menggunakan ion pairing reagent dengan konsentrasi rendah sebagai bahan tambahan ke fase gerak.


Saat dikomplekskan menjadi molekul ion pasangan hidrofobik, analit dipertahankan pada kolom fase terbalik. Ion pairing reagent harus sesuai dengan target analit - sifat basa dipertahankan dengan alkana asam sulfonat dan asam yang kompleks dengan tetrabutilammonium klorida. Hal ini menghasilkan fase gerak yang lebih kompleks dan mengenal lebih jauh potensi impurities (pengotor).


Menggunakan Fase Diam Hidrofobik

Sebuah kolom C18 yang sangat kuat meningkatkan ikatan komponen sampel hidrofilik, tanpa perlu menambahkan ion pairing reagent ke fase gerak.

Kolom Enduro C18G berisi fase diam yang sangat hidrofobik dengan kandungan karbon sebesar 18%. Pengujian telah menunjukkan bahwa kolom ini dapat dijalankan untuk waktu yang lama dalam kondisi air murni tanpa mempengaruhi kinerja.


Contoh
Komponen hidrofilik pada biji kopi panggang dipisahkan secara efektif menggunakan kolom enduro C18G dengan 0,5% asam fosfat dalam air sebagai fase gerak . Kromatogram tersebut menunjukkan bentuk puncak yang simetris untuk semua komponen yang diuji (trigonelline, quinic acid, nicotinic acid dan citric acid).

Berikut hasil kromatogram untuk analisa trigonelline, quinic acid, nicotinic acid dan citric acid:


Minggu, 23 Februari 2014

Sensitivitas Fase Terbalik C18 Terhadap Temperatur

Pengaruh Suhu Berdasarkan Percobaan Dengan Keterulangan Dalam Jangka Waktu Lama

Seperti yang kita ketahui bahwa pemisahan dalam kolom kromatografi lebih efektif jika dipengaruhi oleh suhu, karena memiliki efek pada laju transfer massa (difusi) dan pada interaksi antara analit dengan permukaan kemasan. Oleh karena itu, sebagian besar laboratorium menggunakan column oven untuk mengontrol suhu kolom. Berikut ini data yang diamati selama percobaan untuk menjaga kestabilan kolom dalam jangka panjang.

Sebuah kolom Enduro C18G 150 mm x 4,6 mm ID (5 μm/120 Å) digunakan pada sampel uji yang diinjeksikan setiap 10 menit sebanyak 2.500 kali sedangkan fasa geraknya didaur ulang. Suhu untuk sample compartment, detector cell dan column oven dikontrol.


Kondisi Kromatografi

Kolom                     : 150 mm x 4,6 mm Enduro C18G, 5μm , 120Å

Contoh                   : Theophilline, 4 - nitroaniline, metil benzoat, phenetole dan xilena

Volume injeksi        : 1 µL

Fase gerak              : 80% Acetonitrile dalam air

Run time                : 10 menit isokratik (pelarut didaur ulang)

Laju alir                 :  1,0 ml / menit

Suhu                      : 25°C (column oven), 15°C (sampel), 40°C (detektor)

Panjang gelombang  : 254 nm

Pemisahan diulang sebanyak 2.500 kali.




Hasil

Kinerja kolom tidak memburuk selama periode waktu (2.500 x 10 menit).

Namun pada pemeriksaan lebih jauh terkait waktu retensi, terjadi variasi yang signifikan (data tidak ditunjukkan). Ketika tekanan balik ditinjau selama menjalankan percobaan, data juga menunjukkan beberapa perilaku yang tidak menentu.

Pelarut didaur ulang merupakan satu-satunya penjelasan mengapa variasi terjadi dalam waktu retensi dan tekanan kembali, terjadi fluktuasi suhu ambien (lingkungan) meskipun suhu kompartemen kolom dikontrol. Salah satu keuntungan dari sistem LC yang digunakan adalah bahwa hal itu mengukur dan mencatat suhu di 4 titik berbeda :outside, kompartemen kolom, kompartemen sampel dan sel detektor.

Sebuah alat di kompartemen kolom menunjukkan bahwa kompartemen mempertahankan suhu yang sangat stabil 25°C selama percobaan. Variasi suhu yang signifikan hanya terjadi pada suhu ambien/lingkungan (siang/malam-hari kerja/pekan).

Suhu ambient/lingkungan dan waktu retensi hingga peak terakhir digambarkanterhadap jumlah pengulangan. Sebuah korelasi yang sempurna dapat dilihat (lihat Gambar 1) di mana waktu retensi sangat dipengaruhi oleh perubahan suhu.

Senin, 17 Februari 2014

Cara Memilih Kolom Kapiler GC

Fase diam dalam kolom Enduro terdiri dari unit polimer dasar dengan fungsi yang dapat dimodifikasi dengan penambahan berbagai gugus ketika proses sintesis. Gugus ini dapat ditambahkan dalam berbagai jumlah untuk menciptakan konsentrasi yang berbeda dari fungsi tertentu.

Memilih kolom kapiler yang sesuai untuk pemisahan yang diinginkan mengharuskan anda untuk mempertimbangkan empat parameter dasar: 

  • jenis fase
  • film thickness
  • internal diameter kolom 
  • panjang kolom
Berikut ini panduan untuk membantu Anda memilih kolom yang tepat untuk pekerjaan Anda.

Pemilihan fase

  • Pilih fase paling polar yang akan melakukan pemisahan yang anda inginkan (EN1, EN5, EN5MS dan EN8).
  • Fase diam non-polar memisahkan analit sesuai urutan titik didih. Dengan meningkatkan jumlah fenil dan/atau konten Cyanopropyl pada fase, dan pemisahan ini kemudian lebih dipengaruhi oleh perbedaan momen dipol atau distribusi muatan (EN10 (1701), ENX50 dan ENX70)
  • Untuk pemisahan senyawa yang berbeda dalam kapasitas ikatan hidrogen mereka (misalnya aldehida dan alkohol), polietilen glikol adalah jenis fase yang paling cocok - EN20 (WAX) dan ENSGW


Internal Diameter

  • Semakin kecil diameter semakin besar efisiensinya, yang mengarah pada peningkatan resolusi. Kolom untuk analisa lebih cepat memiliki ID 0.1 mm, digunakan karena resolusi yang sama dapat dicapai dalam waktu singkat.


Film Thickness
  • Untuk sampel yang memiliki variasi konsentrasi, dianjurkan menggunakan kolom dengan film thickness > 0,25 µm. Hal ini akan mengurangi kemungkinan overloaded peaks (peak yang lebar) karena berinteraksi/terelusikan dengan senyawa lain. Jika pemisahan dua zat terlarut cukup namun elusi masih tidak memungkinkan, bahkan dengan perbedaan konsentrasi yang besar, maka film thickness tipis dapat digunakan.
  • Semakin besar ukuran film thickness semakin besar retensi zat terlarut, sehingga semakin tinggi suhu elusi.
  • Dari nilai fase rasio, kolom dapat dikategorikan untuk jenis aplikasi yang paling sesuai: 
    • Semakin kecil nilai fase rasio, berarti semakin besar fase rasio yang masuk kedalam diameter kolom, sehingga akan lebih baik digunakan untuk menganalisis senyawa volatil.
    • Sebaliknya, kolom yang memiliki film tipis umumnya lebih cocok untuk senyawa dengan berat molekul tinggi dan ditandai dengan nilai fase rasio yang besar.
    • Menjaga fase rasio diantara perbedaan ID kolom dapat menghasilkan kromatografi yang sama.
Panjang Kolom
  • Coba untuk selalu memilih panjang kolom yang lebih pendek yang akan memberikan resolusi yang dibutuhkan untuk aplikasi. Jika panjang kolom maksimum yang tersedia sedang digunakan dan resolusi dari campuran sampel masih kurang memadai maka cobalah mengubah fase diam atau internal diameter. 
  • Resolusi sebanding dengan akar kuadrat dari efisiensi kolom, sehingga menggandakan panjang kolom hanya akan meningkatkan daya pemecahan kolom sekitar 40%.


Klik disini untuk dapatkan artikel ini secara berkala....!
Klik disini untuk mendapatkan artikel asli-nya


 


Minggu, 16 Februari 2014

Variasi pH Untuk Meningkatkan Performa Pemisahan Pada Kolom Fase Terbalik (Reversed Phase)

Variasi pH  

Biasanya pH tidak dianggap sebagai sesuatu yang dapat digunakan untuk meningkatkan resolusi dengan penambahan senyawa asam atau basa pada kromatografi fase terbalik karena pada dasarnya silika rentan rusak pada pH > 8. Akan tetapi, jika C18 berikatan dengan gugus silanol yang berbeda pada permukaan silika maupun dengan kelompok C18 lain maka akan membentuk crosslinked, modifikasi polimer inilah yang membuat kolom jauh lebih tahan terhadap pH ekstrim.

Waktu retensi senyawa asam atau basa dapat diubah dengan menyesuaikan nilai pH fase gerak (mobile phase) berdasarkan sampel yang akan kita analisa (senyawa yang bermuatan atau netral). Biasanya, didapatkan hasil yang baik dengan pengaturan pH 1,5 diatas atau dibawah nilai pKa senyawa yang akan dianalisa.


Hasil

Pada pH di bawah pH 8,0, amitriptyline dielusi dengan volume void (1,4 menit). Eksperimen terpisah (tidak ditampilkan) menggambarkan bahwa konsentrasi asetonitril (MeCN) harus turun menjadi 25% untuk mendapatkan waktu retensi amitriptyline sekitar 4 menit. Nitroaniline, ditambahkan untuk mengikat pengotor, memiliki waktu retensi ~ 1,6 menit dengan 70% MeCN. Ketika pH dinaikkan terhadap nilai pKa analit, waktu retensi meningkat tajam menjadi sekitar 12 menit dengan bentuk peak yang sangat luas (karena adanya analit yang bermuatan dan netral). Pada pH di atas nilai pKa, puncak peak menjadi sempit karena didominasi analit bermuatan.Waktu retensi pada pH 12 adalah 5,6 menit dan tidak bergeser jauh ketika pH 13 digunakan (data tidak ditampilkan). Selama percobaan waktu elusi dari unknown impurities (pengotor) diketahui tetap stabil pada retention time 2,4 menit.


Kesimpulan

Mengubah pH merupakan cara mudah, tetapi sering diabaikan untuk memanipulasi waktu retensi analit yang 'bermasalah'. Namun, penting untuk menghindari nilai pH sekitar nilai pKa analit karena bentuk peak menjadi sangat luas dan waktu retensi sangat berfluktuasi walaupun perubahan pH kecil.

Mau dapet artikel berkala tentang kolom dan kromatografi, klik aja disini
Untuk dapatkan artikel aslinya bisa disini

PT Maja Bintang Indonesia

Tidak Semua Kolom C18 Adalah sama

C18 silika berpori yand dimodifikasi (USP kode L1) adalah fase diam yang paling umum dalam analisis HPLC. Lebih dari 400 kolom C18 yang berbeda di pasaran dan ini tidak termasuk  dengan berbagai dimensi kolom. Fase diam ini dapat bervariasi dalam sifat fisik mereka, seperti ukuran partikel dan distribusi, ukuran pori dan distribusi, sebagian atau seluruh matriks berpori dan dalam modifikasi kimia permukaan.
Tujuan artikel ini adalah untuk menjelaskan beberapa karakteristik sifat kimia  modifikasi permukaan dan dampak yang mungkin terjadi di dalam  analisis Anda.
Salah satu fitur semua kolom C18 memiliki kesamaan adalah bahwa permukaannya dimodifikasi dengan C18H37 rantai alkana linear - ini adalah tempat kesamaan akhir. Kolom C18 berbeda dalam kepadatan ikatan, bentuk lampiran, jumlah dan sifat akhir-capping
(End-Capping) dan pengenalan kimia khusus.


Bonding Kepadatan dan Karbon Beban (Bonding Density and Carbon Load)

Kerapatan ikatan adalah jumlah rantai C18 terikat di setiap meter persegi luas permukaan. Nilai-nilai khas untuk ikatan kepadatan adalah antara 2 dan 3 umol / m². Bersama dengan luas ikatan permukaan silika yang kepadatanya spesifik ( Bonding Density) adalah kontributor utama "beban karbon (carbon load)".
Sebuah kepadatan ikatan tinggi meningkatkan "bentuk selektivitas", yang berarti kolom dengan kepadatan ikatan yang tinggi telah memiliki kemampuan untuk membedakan antara molekul "sempit" dan molekul "besar"  bahkan jika mereka memiliki hidrofobisitas yang sama. Molekul yang sempit dapat menembus ke dalam fase diam dipertahankan lagi, sedangkan molekul besar duduk di atas
modifikasi dan elutes sebelumnya. Tinggi ikatan kerapatan fasa diam juga menunjukkan retensi yang lebih baik dari kutub, senyawa hidrofilik  dan kecil kemungkinannya untuk bertahan "fase runtuh".


Monomer vs polimer fase C18

Tergantung pada bahan kimia yang digunakan untuk modifikasi permukaan fase diam, C18 dapat menempel ke permukaan dengan satu atau dengan beberapa obligasi. Silane dengan dua atau tiga kelompok reaktif dapat mengikat beberapa kali untuk berbeda kelompok silanol pada permukaan silika, tetapi juga di antara mereka sendiri. Hasilnya adalah silang, modifikasi polimer yang jauh lebih
tahan terhadap pH ekstrem sebagai mitra monomer mereka. Kelemahan dari modifikasi polimer adalah peningkatan batchto-batch variasi sebagai reaksi polimer jauh lebih sulit untuk mengontrol.



End-capping

Silika kosong/ yang paling sederhana  mengandung sekitar 8 umol / m² silanol (Si-OH)  pada kelompok permukaannya. Silanols ini relatif asam dan dapat menghasilkan interaksi yang tidak diinginkan dengan kelompok dasar dalam analit. Seperti disebutkan sebelumnya, kepadatan ikatan tertinggi yang dapat dicapai dengan ligan besar seperti C18 adalah 2-3 umol / m². Dalam rangka meminimalkan dampak dari gugus silanol residual kedua.Proses modifikasi langkah yang digunakan - kali ini dengan jauh lebih kecil silan (C1-C4). Proses ini disebut akhir-capping dan akan mengurangi jumlah yang tidak bereaksi gugus silanol ke ~ 4 umol / m². Yang paling penting, End-capping menghasilkan sebuah sterik
penghalang yang melindungi analit dari interaksi yang tidak diinginkan dengan silanols. Hasil baik silika ujung bertopi adalah simetris elusi puncak untuk analit dasar seperti amitriptyline.



Pola Tertanam atau Polar End Capped C18

"Tahap runtuh(phase Collapse)" adalah fenomena dimana rantai C18, bila terkena larutan berair murni, mengikat diri mereka sendiri. Diproses "runtuh/Collapse", semua molekul pelarut dikeluarkan dari di antara rantai C18 dan dari antara silika dan rantai C18. Akibatnya fase diam tidak dapat berinteraksi dengan analit dengan benar, waktu retensi bergeser ke yang lebih pendek retensi dan bentuk puncak  menjadi jelek. Tahap runtuhnya adalah reversibel dengan mengekspos kolom ke fase gerak organik tinggi tapi prosesnya lambat. "Polar tertanam" atau "kutub ujung bertopi" fase C18 mengandung gugus hidrofilik (amida, urea,karbamat, sulphonamide atau serupa) dekat dengan permukaan silika. Dalam air kelompok hidrofilik membentuk lapisan air, yang tidak bisa digusur oleh runtuh rantai C18. "Fase runtuh(Collapse Phase)" secara maksimal menjadi tidak mungkin. Fase polar tertanam  menunjukkan hasil yang konsisten dalam fase berair murni dan dalam beberapa kasus menunjukkan bentuk puncak yang lebih baik untuk bahan dasar.


Bagaimana Membandingkan Kolom

Lembaga Nasional untuk Standar dan Teknologi (NIST) mengembangkan tes untuk kolom C18 (SRM870). Uji campuran mengandung lima komponen: urasil sebagai penanda untuk, toluena dan etilbenzena sebagai ujian untuk hidrofobik dan metil spesifisitas, quinizarin sebagai chelator sensitif terhadap interaksi logam non-spesifik dan amitriptyline sebagai dasar dan probe untuk kegiatan silanol.Gambar 1 menunjukkan kromatogram khas untuk tipe-I silika, silika dengan aktivitas silanol, silika dengan aktivitas logam dan Enduro C18Q.
Pharmacopeial Konvensi Amerika Serikat  (http://www.usp.org/app/USPNF/columns.html) daftar hasil  kolom untuk NIST mereka sejumlah 870 . Informasi ini dapat digunakan untuk merencanakan faktor tailing untuk kegiatan silanol terhadap faktor tailing kegiatan logam yang memungkinkan penentuan kolom inertness.( Lihat Gambar dibawah)


Kesimpulan

Banyak tersedia secara komersial yang berbeda- beda dari C18 baik dalam sifat fisik mereka, tetapi yang lebih penting dalam komposisi kimia nya. Alat seperti 870 tes NIST dalam kombinasi dari pemahaman yang baik tentang sifat sampel dapat membantu analis untuk memilih kolom yang "benar" untuk analisis. Secara umum, kolom lembam dengan sifat retensi yang baik akan memberikan
Anda dengan setup fleksibel untuk mengatasi sebagian besar tugas pemisahan. Namun, jika Anda harus bekerja pada pH tinggi atau 100% lingkungan berair ada sejumlah pilihan yang tersedia dalam memilih kolom C18 tepat untuk aplikasi Anda. 





Mau dapet artikel kromatografi secara berkala, klik disini
Klik disini untuk artikel aslinya